瘦素检测试剂盒（酶联免疫法）操作说明

瘦素检测试剂盒（酶联免疫法）操作说明

瘦素检测试剂盒（酶联免疫法）

【产品名称】

通用名称：瘦素检测试剂盒（酶联免疫法）

英文名称：Leptin (Sandwich) ELISA

【产品规格】

96T

【预期用途】

试剂盒可用于人血清和血浆中瘦素的定量检测。

【检测原理】

DRG公司的瘦素酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶免吸附实验（ELISA），微孔内包被有能结合瘦素分子上*抗原位点的单克隆抗体。含有内源性瘦素的病人样本在包被孔中与特异性兔抗瘦素抗体进行温育，之后就会形成一个夹心复合物。温育后，用洗涤液洗去未结合的物质，再加入链霉亲和素过氧化物酶复合物来检测结合的瘦素，加入底物溶液，颜色强度与病人样品中瘦素的浓度成正比。

【试剂盒组成成分】

微孔板          12×8

包被了抗瘦素单克隆抗体。

标准品（0~5）   6×0.5ml

浓度0、2、5、25、50、100ng/ml 内含无汞防腐剂。

质控品          2×0.5ml

即用型、具体数值与范围请见试剂瓶标签或QC质控单、内含无汞防腐剂。

分析缓冲液      1×11ml

即用型

抗血清          1×11ml

即用型、生物素化抗瘦素单抗、内含无汞防腐剂。

酶联物          1×11ml

即用型、含辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、内含无汞防腐剂。

底物液          1×14ml

含TMB、即用型。

终止液          1×14ml

即用型、内含0.5M的H₂SO₄、避免接触终止液、以免刺激皮肤或灼伤皮肤。

洗涤液          1×30ml

40倍浓缩

注：根据需要可额外订购样本稀释用的零标准品。

所需材料（未提供）

1) 酶标仪 （450±10nm）

2) 精确取样枪

3) 吸水纸

4) 蒸馏水

5) 计时器

6) 半对数坐标纸或数据处理软件

【储存条件】  

未开封的试剂在2~8℃下可保存至有效期，不要使用过期的试剂。

开封的试剂和微孔板必须贮存于2~8℃，密封袋一旦打开后，应立即密封好。

【样本要求】

此试验采用血清或血浆。

不要使用溶血，脂血或黄疸血样本。

注意：含有叠氮化物的样本不能使用。

样本采集

血清

静脉采血采集全血，允许凝集，室温下离心分离出血清；样本未*凝集前不能离心；含有抗凝剂的样本可能需要更长的凝集时间。

血浆

将全血采集至含有抗凝剂的离心管内，离心分离。

样本储存

样本采集后盖好盖子，2~8℃下可保存24小时；若要保存更长时间，则需冻存于-20℃；解冻的样本实验前来回倒置数次混匀。

样本稀释

初次试验中，若出现样本的浓度值高于最高标准，则需将样本进行进一步的稀释，并重新检测，最终结果应乘以相关的稀释因子。

例如：

A) 1:10稀释          10ul的血清+90ul的零标准品（充分混合）

B）1:100稀释  10ulA)1:10稀释的+90ul的零标准品（充分混合）

【检测方法】

实验前将所有试剂和试验所需板条平衡至室温。

标准品

加0.5ml的去离子水至标准品试剂瓶内，，静置10分钟，使用前混匀。

注意：配制的标准品在2~8℃下可保存6周，需保存更长时间需在-20℃下冻存。

质控品

加0.5ml的去离子水至质控品试剂瓶内，，静置10分钟，使用前混匀。

注意：配制的标准品在2~8℃下可保存6周，需保存更长时间需在-20℃下冻存。

洗涤液

30ml的浓缩洗涤液+1170ml的去离子水混合，得到1200ml的即用型洗涤液；稀释的洗涤液可在室温下保存2周。

检测步骤

每次实验都要建立标准曲线。

1) 将实验所需板条固定于板架上。

2) 加15ul的标准品，质控品和样本于相应的孔内。

3) 每孔加100ul的分析缓冲液；充分混合10秒，此步中*混合很重要。

4) 室温下，不盖板，温育120min。

5) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

   注意：试验灵敏度和精确度与洗板准确与否相关。

6) 每孔加100ul的抗血清。

7) 室温下温育30min。

8) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

9) 每孔加100ul的酶联混合物。

10) 室温下温育30min。

11) 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板3次，吸水纸上拍干。

12) 每孔加100ul的底物液。

13) 室温下温育15min。

14) 每孔加50ul的终止液。

15) 加入终止液10min内在酶标仪450±10nm处读数。

【结果计算】

1) 计算各标准品，质控品和样本的OD均值。

2) 在半对数坐标纸上，以标准品的OD均值为Y轴，浓度为X轴绘制标准曲线。

3) 样本的浓度可直接从标准曲线上读取。

4) 自动计算方法：说明书中的标准曲线是通过4参数逻辑函数法计算得到，4PL是最佳方法，其他的方法可能会有些许的偏差。

5) 样本浓度可直接从标准曲线上读取；若样本浓度值高于最高标准品，则需进一步稀释重新检测；最终结果计算时应乘以相关的稀释因子。

典型标准曲线示例

以下数据仅供解释说明，不能用作试验的计算。

【注意事项】

1) 此试剂盒仅供科研使用。

2) 试剂盒内所有含人血清或血浆的试剂都已经过FDA检测HIV I/II, HBsAg 和HCV呈阴性，但使用及处理时应视其为潜在生化危害物质对待。

3) 实验开始前，认真阅读试剂盒内配套的使用说明书，确保*理解。

4) 微孔板可拆，未使用的板条应放回至密封袋内贮存于2-8℃。

5) 每次加样要快，加样顺序应一致。

6) 一个试剂瓶只能用于装一种试剂，尤其是底物液试剂瓶；若用装过了酶联物的试剂瓶重新装底物液的话则会发生的溶液颜色改变，且不能将剩余溶液倒回至原试剂瓶，以免污染试剂。

7) 微孔板内的试剂应*混匀，确保得到好的结果，不要重复使用微孔板。

8) 试验中，不要使微孔出现干燥，洗板后立即加入下一个试剂。

9) 实验前将所有试剂平衡至室温，温度会影响吸收值的读取，但是样本值不会受影响。

10) 不要用嘴吸样，避免接触试剂和样本。

11) 实验区禁止抽烟，饮食或化妆。

12) 处理样本和试剂时佩戴一次性手套，微生物污染的试剂或样本会导致错误的结果。

13) 严格按照相关国家生物安全法规要求来处理。

14) 不要使用过期的试剂。

15) 加样量严格按说明书要求来，使用校准加样器和酶标仪则会得到最佳结果。

16) 不要混合使用不同批次的试剂，也不能交换同一批次的板条；运输或贮存环境不同和微孔板的结合特性会导致结果些许差异。

17) 避免接触终止液，会腐蚀和烧伤皮肤。

18) 含有Proclin 300, BND 和 MIT作为防腐剂的试剂应避免接触，若接触到则立即用大量水进行冲洗。

19) TMB底物液具有刺激作用，若接触到则立即用肥皂清洗和大量水冲洗。

20) 化学物质和配制的试剂应根据国家生化危害安全规章要求处理。

21) 试剂盒内相关危害物质信息详见MSDS，可向DRG索取。

【操作注意事项】

1) 实验前，所有试剂和样本都应平衡至室温，混合时避免出现气泡。

2) 实验一旦开始，必须无中断的完成全部试验。

3) 避免交叉污染，每次加样时都使用新的枪头。

4) 吸收值与温育时间和温度有关，试验开始前，将所有试剂准备好，打开盖子，所需板条固定于板架上等，确保无间断的，时间间隔一致的加样。

5) 酶反应一般规则，时间和温度是一个线性相关关系。

仅供科研使用