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人胰岛素原(PI)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明

发布时间:2023-11-15   点击次数:706次

人胰岛素原(PI)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明

PI简介:

胰岛素原(PI)是胰岛素的前体激素,它是由由胰岛β细胞合成和分泌,主要在肾脏分解代谢。生理情况下,只有极少量的胰岛素原释放入血,在病理情况下,胰岛β细胞释放胰岛素原增多,血中胰岛素原水平升高。它是细胞在裂解成成熟胰岛素之前分泌的最后一个单链蛋白结构。它是由芝加哥大学的Donald F. Steiner教授在1967年发现的

实验原理:

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被有人胰岛素原(PI)捕获抗体的微孔中,依次加入本、标准品、生物素标记的检测抗体,HRP酶结合物,中间经过温育洗涤用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素原(PI)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

试剂盒组成

名称

96孔配置

48孔配置

备注

预包被96孔酶标板

Pre-coated Assay Plate

8×12

8×6

标准品

Standard

2

1

按说明书进行稀释

通用稀释液

Universal Diluent

2x20mL

1x20mL

浓缩生物素化检100×

BiPIin-antibody (100×)

120μL

60μL

按说明书进行稀释

浓缩酶结合物100×

Streptavidin-HRP (100×)

120μL

60μL

按说明书进行稀释

2洗涤液

Wash Buffer (2)

2x10mL

1x10mL

按说明书进行稀释

底物TMB

TMB Substrate

10mL

5mL

终止液

Stop Solution

6mL

3mL

封板膜

Plate Sealer

4

4

说明书

PItruction Manual

1

1

 

 

试剂盒参数:

性能


灵敏度

4.9 pg/mL

检测范围

12.5-800pg/mL

特异性

可检测样本中人的PI,且与其类似物无明显交叉反应

 

需自备的设备及试剂: 

1. 450±10nm 滤光片酶标仪

2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸馏水或去离子水.

5. 脱脂棉吸水纸.

6. 37℃恒温箱.

8. 准备若干个标准品稀释管.

样本稀释方案:

请提前预估样本的浓度范围 ,如果您的检测样本需要稀释 ,参考稀释方案如下:

稀释 100 倍 :一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内 ,做 100 倍稀释;

 

稀释 1000 倍: 两步稀释 。 取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内 ,做 20 倍稀 释 ,再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ,做 50 倍稀释 ,总共稀释 1000 倍;

 

稀释 100000 倍 :三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内 ,做 40 倍 稀释 ,再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ,做 50 倍稀释 ,最后 取 5μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ,做 50 倍稀释 ,总共稀释100000 倍;

 

每步稀释时取液量不少于 3μL ,稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均匀 ,避免起泡。

 

 

 

 

 

 

样本处理及要求:

1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

2. 血浆:EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

4. 细胞培养物上清:1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本:1000×g离心20分钟,取上清即可检测。

6. 样品外观:样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。

7. 样品保存:样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融,标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

检测前准备工作

1. 10分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。

标准品梯度工作液配制:加入1mL通用稀释液至冻干标准品,静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为800pg/mL),然后按照以下浓度:800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、0pg/mL进行稀释

比稀释方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀释液,200pg/mL的标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成100pg/mL的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔,不需要再从倒数第二管中吸取液体,具体如下图


1. 生物素化检抗工作液配制:使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟,以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例:10μL浓缩液+990μL通用稀释液)当日使用。

2. 酶结合物工作液配制:使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟,以通用稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度(例:10μL浓缩液+990μL通用稀释液)当日使用

3. 1×洗涤液配制10ml 20×洗涤液到190ml蒸馏水中(从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,放置室温,轻摇均匀,待结晶溶解后再配置)。

操作步骤:

1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。


2. 加样分别将样品或不同浓度标准品按照100μl孔加入相应孔中,空白孔加入100μL通用稀释液盖上封板膜后37℃温育1小时。建议待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响最后计算样本浓度时乘以对应的稀释倍数所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔)。

 

 

3. 加生物素化抗体取出酶标板,弃去液体,不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μL,盖上封板膜后37℃温育1小时。

 

 

4. 洗板:弃去液体,每孔300μL 1x洗涤液,静置1分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板3次(也可用洗板机洗板)。

 

 

5. 酶结合物工作液每孔加入酶结合物工作液100μL,盖上封板膜后37℃温育30分钟。

 

 

6. 洗板弃去液体按步骤4洗涤方法5次

 

 

7. 加底物每孔加入底物(TMB)90μL,盖上封板膜,37℃避光温育15分钟。

 

8.  加终止液取出酶标板,每孔直接加入终止液50μL,立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

 


结果判断

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线

以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

浓度(pg/mL)

800

400

200

100

50

25

12.5

0

OD

2.32

1.93

1.31

0.85

0.51

0.39

0.28

0.1

校正OD

2.22

1.83

1.21

0.75

0.41

0.29

0.18

-

 



试剂盒性能:

1. 重复性:板内变异系数小于10%,板间变异系数小于10%。

2. 回收率:在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人PI,计算回收率

样本类型

范围

平均回收率

血清(n=8)

84-101

96

血浆(n=8)

92-105

102

细胞培养上清(n=8)

96-108

105

 

 

 

 

 

 

3. 线性稀释:分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人PI,在标准曲线动力学范围内进行稀释,评估线性。评估线性。

稀释比例

回收率(%

血清

血浆

细胞培养上清

12

范围(%

84-95

88-96

90- 110

平均回收率(%

91

93

96

14

范围(%

89-103

87-108

105- 115

平均回收率(%

94

98

109