RJ11723人γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒

RJ11723人γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒

干扰素（ IFN-γ ,  又称  II  型干扰素或免疫干扰素）是一种主要由T淋巴细胞 和自然杀伤细胞产生的细胞因子。该蛋白与IFN-β或各种IFN-α家族蛋白没 有明显的同源性。成熟的  IFN-γ以非共价连接的同质体存在。人类IFN-γ具 有高度的物种特异性 ，只在人类和灵长类细胞中具有生物活性。IFN-γ最初 是基于其抗病毒活性而被定性的。该蛋白还发挥抗增殖、免疫调节和促进炎 症的活性 ， 因此在宿主防御机制中很重要。IFN-γ诱导细胞因子的产生 ，上 调 I  类和 II  类  MHC  抗原、Fc  受体和白细胞粘附分子的表达。它调节巨 噬细胞的效应功能 ，影响异型转换并增强 B  细胞分泌免疫球蛋白的能力。

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ ELISA） 。往预先包被有人 γ干扰素(IFN-γ)捕获抗体的微孔中 ，依次加入样本、标准品、生物素标记的检 测抗体 ，HRP酶结合物 ， 中间经过温育和洗涤 ，用底物TMB显色 ，TMB在过 氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色 的深浅和样本中的人γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。用酶标仪在 450nm  波长下测 定吸光度（ OD值） ，计算样本浓度。

灵敏度：0.54pg/mL

特异性：可检测样本中人的IFN-γ ,  且与其类似物无明显交叉反应

1.    试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围 ，建议实验前通过相 关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度。如 果样本中待测物浓度过高或过低 ，请对样本做适当的稀释或浓缩。

2.    若所检样本不在说明书所列样本类型之中 ，建议做预实验验证其检测有 效性。

3.    血清 ：将收集于血清分离管的全血样本在室温放置2小时或2-8℃过夜 ，    然后1000×g离心20分钟 ，取上清即可 ，或将上清置于-20℃或-80℃保存， 但应避免反复冻融。

4.    血浆 ：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集样本 ，并将样本在采集后的30分  钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟 ，取上清即可检测 ，或将上清置于-20℃ 或-80℃保存 ，但应避免反复冻融。

5.    组织匀浆 ：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织 ，去除残留血液（匀  浆中裂解的红细胞会影响检测结果） ，称重后将组织剪碎。将剪碎的组 织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比 ，比如1g的组织样本对应 9mL的PBS ，具体体积可根据实验需要适当调整 ，并做好记录。推荐在  PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中 ，于冰上充分研磨或匀浆  机研磨。为了进一步裂解组织细胞 ，可以对匀浆液进行超声破碎 ，或反 复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~ 10分钟 ，取上清检测。

6.    细胞培养物上清 ：请1000×g离心20分钟 ，取上清即可检测 ，或将上清

置于-20℃或-80℃保存 ，但应避免反复冻融。

7.    细胞裂解液 ：贴壁细胞用预冷PBS轻轻清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，

1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞   用预冷PBS清洗3次 ，每1×10^6个细胞中加入150-200μL PBS重悬（推     荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少PBS体积）并通    过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃ ,  1500×g离心10分钟， 取上清检测。

8.    其它生物样本： 1000×g离心20分钟 ，取上清即可检测。

9.    样本外观 ：样本应清澈透明 ，悬浮物应离心去除。

10.  样本保存 ：样本收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃ ,  若不能及时 检测 ，请按一次使用量分装 ，冻存于-20℃（ 1个月内检测） ，或-80℃    （ 6个月内检测） ，避免反复冻融 ，样本溶血会影响最后检测结果 ， 因   此溶血样本不宜进行此项检测。

 请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：

稀释 100 倍：一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；

稀释 1000 倍 ：两步稀释。取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内 ，做 20 倍稀释 ， 再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ， 做 50 倍稀释 ， 总共稀释 1000 倍；

稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内 ，做 40 倍稀 释 ，再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后取 5 μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 100000 倍；

每步稀释时取液量不少于 3μL ，稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均 匀 ，避免起泡。

1.    请提前从冰箱中取出试剂盒 ，平衡至室温。

2.    标准品梯度工作液配制：加入 1mL  通用稀释液至冻干标准品中 ，静置15 分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为100pg/mL)，然后按照以下浓度：

100pg/mL、 50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、6.25pg/mL、3. 12pg/mL、

1.56pg/mL、0pg/mL进行稀释。

倍比稀释方法 ：取7支EP管 ，每管中加入500μL通用稀释液, 100pg/mL  的    标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成50pg/mL  的标准品工 作液 ，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔 ，不需要再 从倒数第二管中吸取液体 ，具体如下图。

3.    生物素化检抗工作液配制：使用前15分钟将100×浓缩生物素化检抗于  1000×g离心1分钟 ，以通用稀释液将100×浓缩生物素化检抗稀释成1×工 作浓度(例： 10μL浓缩液+990μL通用稀释液) ，现配现用。

4.    酶结合物工作液配制 ：使用前15分钟将100×浓缩酶结合物于1000×g离 心1分钟 ，以通用稀释液将100×浓缩酶结合物稀释成1×工作浓度(例： 10 μL浓缩液+990μL通用稀释液) ，现配现用。

5.    1×洗涤液配制：取10mL 20×洗涤液到190mL蒸馏水中（从冰箱中取出的 浓缩洗涤液可能有结晶 ，属于正常现象 ，可放置室温 ，待结晶溶解 后再配制)。

操作步骤：

1.    从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条 ，剩余板条用自封袋密封 放回4℃。

2.    加样 ：分别将样本或不同浓度标准品按照100μL每孔加入相应孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育60分钟。（建议：

将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减   少基质效应对测试结果的影响 ，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释 倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3.    加生物素化检抗 ：取出酶标板 ，弃去液体 ，不用洗涤。每孔直接加入

100μL生物素化检抗工作液 ，盖上封板膜后37℃温育60分钟。

4.    洗板 ：弃去液体 ，每孔加入300μL 1x洗涤液 ，静置1分钟 ，甩去洗涤液， 吸水纸上拍干 ，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。

5.    加酶结合物工作液 ：每孔加入100μL酶结合物工作液 ，盖上封板膜后 37℃温育30分钟。

6.    洗板 ：弃去液体按步骤4洗涤方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，盖上封板膜 ，37℃避光温育15分钟。

8.    加终止液 ：取出酶标板 ，每孔直接加入50μL终止液 ，立即在450nm波长 处测定各孔的OD值。

结果判断：

1.    计算标准品和样本复孔的平均  OD  值并减去空白孔的  OD  值作为校 正值。 以浓度为横坐标 ，OD  值为纵坐标 ，在双对数坐标纸上绘出四参 数逻辑函数的标准曲线。

2.    若样本 OD  值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测并在计算样本浓度 时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考 ，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

注意 ：本图仅供参考 ，应以每次实验数据所绘制标准曲线计算样本含量。

1.    重复性 ：板内变异系数小于  10% ，板间变异系数小于  10%。

2.    回收率 ：在选取的健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入  3  个不同 浓度水平的人IFN-γ ,  计算回收率。

3.    线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入

高浓度人IFN-γ ,  在标准曲线动力学范围内进行稀释 ，评估线性。